CpG의 상태를 읽는 기술

DNA 서열 자체를 바꾸지 않고도 유전자 조절 상태가 달라질 수 있습니다. 대표적인 표지가 사이토신에 붙는 메틸기입니다.

MOLECULAR PRINCIPLE

5-methylcytosine · 5mC

CpG dinucleotide의 사이토신 5번 탄소에 –CH₃가 붙어 5mC가 됩니다. 프로모터 CpG island, enhancer, gene body 등의 메틸화 상태는 전사 조절과 연동될 수 있습니다.

β = M / (M + U + α) · 0 = unmethylated, 1 = fully methylated

HOW WE READ

Bisulfite chemistry와 두 판독 경로

Bisulfite 처리 후 비메틸화 C는 U로 바뀌어 시퀀싱에서 T로 읽히고, 5mC는 C로 남습니다. EPIC은 프로브의 형광 신호로, WGBS는 C/T 비율로 methylation level을 계산합니다.

🧪

Bisulfite

C → U/T
5mC → C

▦

EPIC

probe signal
β value

📖

WGBS

C/T counts
per CpG

반드시 구분할 것: conventional bisulfite 방법에서는 5mC와 5hmC를 구분하지 못합니다. 5hmC가 중요하면 oxBS-seq, TAB-seq, EM-seq와 같은 별도 접근을 검토해야 하며, bisulfite는 DNA fragmentation과 mapping bias를 유발할 수 있습니다.

근거: Huang et al. (2010), Illumina Infinium Methylation documentation, NEB bisulfite sequencing notes.

왜 메틸레이션을 연구하는가?

유전형이 비교적 고정된 정보라면, methylome은 조직·시간·환경과 함께 변하는 조절 층위입니다.

01 · GENE REGULATION

서열은 그대로, 활성 상태가 변한다

프로모터 CpG island hypermethylation은 전사 억제와 연결될 수 있으며, enhancer·gene body의 변화는 조직 특이 발현, splicing, X-inactivation, imprinting 등과 관련됩니다.

02 · ENVIRONMENT & AGING

삶의 흔적과 생물학적 나이

흡연, 식이, 스트레스, 화학물질 노출, 노화는 재현 가능한 CpG 패턴을 남길 수 있습니다. 이 패턴을 이용해 epigenetic clock과 노화 연구를 설계합니다.

03 · DISEASE & BIOMARKER

질병 관련 molecular signature

암·대사·자가면역 연구에서 질병군과 대조군의 DMP·DMR을 비교할 수 있습니다. cfDNA methylation, 조직 기원 추정, 후보 biomarker 탐색으로 확장됩니다.

04 · INTERPRETATION RULE

연관, 발현, 인과를 분리한다

methylation association ≠ causation
methylation ≠ gene expression
조직·세포 조성 변화가 신호의 원인일 수 있음
RNA-seq·단백질·기능 실험으로 추가 검증 필요

근거: Horvath & Raj (2018) epigenetic clock theory, Titus et al. (2017) cell-type deconvolution.

좋은 결과는 설계에서 시작된다

메틸레이션 연구의 해석력은 분석 알고리즘만이 아니라 검체, 비교 설계, 공변량, batch 관리에서 결정됩니다.

SAMPLE

검체 유형

Fresh/frozen tissue: WGBS·EPIC에 이상적
Whole blood/PBMC: 접근성이 높지만 cell deconvolution 필요
FFPE: fragmentation·crosslinking 주의, EPIC restoration 고려
cfDNA·saliva: low-input과 세포 조성 고려

DESIGN

어떤 비교인가?

Case–control: 질병군과 대조군 매칭
Longitudinal: 동일 개체의 시간 변화
Tissue comparison: 정상·병변 또는 조직 간 비교
Pooled screening → 독립 validation

CONFOUNDERS

무엇 때문인지 분리

cell composition
batch·chip position·sequencing run
성별·연령·흡연·음주·약물
tumor purity·DNA 품질·conversion rate
multiple testing·FDR

실험 설계 원칙: 모든 샘플을 같은 방식으로 처리하고, 실험 순서를 섞어 특정 그룹이 한 번에 처리되지 않게 합니다. 또한 성별·연령·세포 비율·실험 batch를 분석에 함께 넣어야 그룹 차이를 더 정확하게 판단할 수 있습니다.

추천 분석 도구: minfi, SeSAMe, Houseman/EpiDISH, RUV, ComBat, SVA. 모든 도구는 연구 설계와 데이터 품질에 맞춰 선택합니다.

EPIC array · 표적 프로브 기반 genome-wide 지도

미리 정해진 CpG probe를 대량 병렬 판독해 재현성 있는 β value, DMP, DMR을 얻습니다.

WHAT IT MEASURES

~935K CpG의 β 값

Infinium I/II probe가 methylated/unmethylated 신호를 형광으로 측정합니다. 프로모터, enhancer, gene body 등 연구 관심 영역을 균형 있게 커버합니다.

🧬

DNA

gDNA

🧪

Bisulfite

conversion

▦

BeadChip

probe signal

📊

IDAT

β matrix

BIOINFORMATICS

IDAT → QC → DMP/DMR → pathway

QC: detection p, bead count, sex prediction, cross-reactive probe 제거
Normalization: Noob, SWAN, funnorm 등
DMP: limma linear model + covariates
DMR: bumphunter, DMRcate, comb-p
해석: missMethyl, GO/KEGG/Reactome

예시 input

≥250 ng

권장 500 ng · 프로토콜 의존

예시 throughput

8 samples / chip

EPICv2 표준 예시

주요 한계

probe-bound

비표적 CpG는 직접 측정하지 않음

EPIC이 적합한 경우: 많은 샘플의 EWAS, cohort screening, FFPE archive study, 표준화된 biomarker 후보 탐색. EPIC은 미리 정해진 위치를 빠르게 비교하는 방법이므로, 모든 DNA 위치를 확인하는 것은 아닙니다.

근거: Illumina EPIC v2 product page, Illumina Knowledge Base 000002679, Peters et al. (2024), Kaur et al. (2023), minfi Bioconductor.

WGBS · 염기 수준의 whole-genome methylome

프로브가 정해지지 않은 전체 유전체를 읽어 전 CpG와 비-CpG, 새로운 영역까지 탐색합니다.

WHAT IT MEASURES

~28M CpG · single-base resolution

각 CpG에서 methylation level을 C reads / (C+T reads)로 계산합니다. CpH, imprinting, allele-specific methylation, enhancer 등도 분석 범위에 포함될 수 있습니다.

🧬

HMW gDNA

고품질 DNA

✂️

Library

fragmentation

📖

PE150

bisulfite reads

🧭

CpG call

methylation map

BIOINFORMATICS

FASTQ → methylation call → DMR

Trim: adapter·bisulfite 특이 편향 정리
Map: Bismark, BSMAP, gemBS
Calling: MethylDackel, methylKit
QC: lambda conversion, duplication, uniformity
DMR: DSS, dmrseq, BSmooth
Annotation: gene·enhancer·chromatin state

예시 input

10–100 ng

HMW gDNA · kit/protocol 의존

사람 genome 예시

≥30×

유효 CpG depth 확보 목적

주요 부담

FASTQ/BAM

시퀀싱·저장·계산 자원 증가

WGBS가 적합한 경우: 새로운 methylated region, 비-CpG methylation, imprinting, allele-specific signal, probe 밖의 영역까지 발견하고 싶은 연구. 높은 해상도로 분석하려면 더 많은 데이터를 생산해야 하고, 많은 위치를 비교하는 과정에서 통계적으로 우연히 보이는 결과가 없는지 확인해야 합니다.

근거: ENCODE MethylC-Seq Standards, Ziller et al. (2015), Zymo-Seq WGBS kit protocol D5465, Bismark/methylKit documentation.

EPIC vs WGBS · 한 표로 선택하기

같은 methylome을 다른 해상도로 봅니다. 발견·범위·샘플 수·예산·검체 품질을 함께 고려하세요.

항목	EPIC array	WGBS
읽는 대상	표적 probe가 있는 CpG, 약 935K	전체 gDNA의 CpG, 약 28M
해상도	probe 단위 β value	single-base methylation level
입력 예시	≥250 ng, 권장 500 ng	10–100 ng HMW gDNA 예시
대표 데이터	IDAT, β matrix, DMP/DMR	FASTQ/BAM, CpG calls, DMR
강점	대규모 EWAS, 표준화, 재현성, 비교적 낮은 부담	프로브 밖 영역, CpH, imprinting, allele-specific 탐색
한계	비타깃 CpG 미측정, probe·batch 편향, 5mC/5hmC 미구분	높은 depth·비용, DNA 손상, mapping bias, 5mC/5hmC 미구분
우선 고려	많은 샘플의 screening·EWAS·FFPE archive	발견 연구·새 영역·고해상도 methylome

QUESTION A

많은 샘플·재현성

EPIC v2.0으로 cohort를 스크리닝하고, 후보 DMR을 별도 방법으로 검증합니다.

QUESTION B

새 영역·높은 해상도

WGBS로 enhancer, CpH, imprinting, allele-specific methylation까지 탐색합니다.

QUESTION C

발견 → 검증

EPIC screening → WGBS 또는 targeted BS-seq → RNA·단백질·기능 검증으로 연결합니다.

어느 해상도로
메틸레이션을 볼 것인가

CpG의 상태를 읽는 기술

5-methylcytosine · 5mC

Bisulfite chemistry와 두 판독 경로

Bisulfite

EPIC

WGBS

왜 메틸레이션을 연구하는가?

서열은 그대로, 활성 상태가 변한다

삶의 흔적과 생물학적 나이

질병 관련 molecular signature

연관, 발현, 인과를 분리한다

좋은 결과는 설계에서 시작된다

검체 유형

어떤 비교인가?

무엇 때문인지 분리

EPIC array · 표적 프로브 기반 genome-wide 지도

~935K CpG의 β 값

DNA

Bisulfite

BeadChip

IDAT

IDAT → QC → DMP/DMR → pathway

WGBS · 염기 수준의 whole-genome methylome

~28M CpG · single-base resolution

HMW gDNA

Library

PE150

CpG call

FASTQ → methylation call → DMR

EPIC vs WGBS · 한 표로 선택하기

많은 샘플·재현성

새 영역·높은 해상도

발견 → 검증

이 분석이 필요하신가요?